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如何選擇酶標儀的測定波長?不同波長有什么區(qū)別?

作者:酶標儀    時間:2022-06-30 11:28:16    點擊次數(shù):3010
 

    如何選擇酶標儀的測定波長?酶標儀測定波長選擇的依據(jù)是:使用不同標記酶對應的底物的不同,其催化顯色反應后吸收波長不同,因此需要選擇不同的測定波長。

酶標儀

    一般酶標儀的測定波長在400~750nm或800nm之間,完全可以滿足ELISA的顯色測定。目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP),底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD),其在過氧化氫溶液的存在下,經(jīng)HRP作用,分別氧化為2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當pH值為5.0左右時,DAB在450nm波長處有較大wgxbreat吸收,當pH值降為L 0時,較大吸收波長移至492 nm,同時摩爾消光系數(shù)變大,顯色加深,因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有較大消光系數(shù),如果HRP量少,H:O:和TMB過量時,則形成藍色的陽離子根。


    降低pH,即可使藍色的陽離子根轉變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此,450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉換的部件,可以同時安裝6~8片濾光片,所配備的濾光片均應包括上述兩個波長,有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,影響不大。


    除了這兩個基本濾光片外,考慮到雙波長比色的需要,還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片,其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時,有的實驗室希望用酶標儀作微量生化測定,故醫(yī)療設備生產(chǎn)廠家對其生產(chǎn)的酶標儀擴展了紫外檢測功能,此時需要一個340 nm波長濾光片。此時,酶標儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm。


    酶標儀有單波長和雙波長檢測功能。有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具較大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定;而“雙波長”則除了用對顯色具較大吸收的波長即450 nm或492 nm進行比色測定外,同時用對特異顯色不敏感的波長如630 nm進行測定,酶標儀打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長下得到的吸光度是非特異的,來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此,在ELISA比色測定中,使用雙波長,且不必設空白孔。


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